Прескочи към главното съдържание на страницата

Архив


БРОЙ 3 2020

Менингококови менингити. Диагностика и серотипизиране чрез молекулярни методи

виж като PDF
Текст A
доц. д-р Виктория Левтерова, гл. ас. Иван Симеоновски, гл. ас. Надя Бранкова, проф. д-р Тодор Кантарджиев
НРЛ Молекулярна Микробиология, отдел Микробиология, Национален център по заразни и паразитни болести


Менингококовият менингит изисква бързо и точно диагностициране, за да се започне навременно лечение с правилно подбрана антибиотична терапия. Целта на нашето проучване е да се оцени ефективността на молекулярната диагностика с полимеразно-верижна реакция на N. meningitidis. Полимеразно-верижната реакция в реално време е много чувствителен и специфичен метод за откриване и последващо типизиране на Neisseria meningitides. Методът е особено полезен при рутинно изследване на пациенти – както за идентификация, така и за типизиране на менингококи. Бяха изследвани 245 клинични проби за откриване или потвърждаване на бактериален менингит като етиология, за период от 6 години – от януари 2013 г. до януари 2019 г. От тях 52 бактериални менингита са причинени от N. meningitidis при пациенти на възраст от 2 месеца до 83 години. Останалите 193 са отрицателни за менингококи и вероятно са с други етиологични причинители.

ключови думи: N. meningitidis, real time PCR, serotyping

  Въведение

Менингитът е тежко заболяване. Представлява възпаление на обвивките на мозъка – менингите. Според етиологичния причинител менингитите се делят на две големи групи – бактериални и вирусни.

Етиологията на бактериалните менингити е разнообразна. В зависимост от сезона и възрастта има предоминация на различни бактериални причинители. Менингококовите менингити преобладават през пролетно-зимния сезон. Neisseria meningitidis е бактерий, който е основен причинител в световен мащаб на потенциално животозастрашаващи менингит и септицемия, които носят със себе си висок процент смъртност и при някои случаи трайни физически и неврологични последствия. Менингококите продължават да бъдат сред водещите причинители на бактериален менингит в света. Менингококите на серогрупа В са признати за едни от основните причинители на бактериални менингити в Европа[39], а също така и в България. През последните години се наблюдава повишаване на случаите и от серогрупа С, W и Y.

Етиологичният агент Neisseria me­nin­­gitidis са грам-отрицателни диплококи, които са човешки патогени. Менингококите колонизират лигавицата на назофаринкса. Най-често тази колонизация е безсимптомна и се среща при около 10% от населението. Те заразяват само хората и никога не са били изолирани от животни, поради това че бактериите не могат да получават желязо, различно от пренасяното от човешкия протеин (трансферин). Механизмът на това усвояване е уникален за този микроорганизъм.

N.meningitidis е един от трите основни патогена, които причиняват остър бактериален менингит, заедно със S. pneumoniae и H. influenzae[1]. От формите на остър бактериален менингит N. meningitidis причинява менингококов менингит и стои в първите 10 причини за летален изход по света в резултат на инфекция. Около една трета до половината от хората оцелели след тази инфекция остават трайно увредени от нея[2].

Прояви на тези последствия може да са загуба на слух, хронична умора или безсъние, неврологични увреждания, както и загуба на части от кожата, а понякога и крайници поради ограничен приток на кръв към тези тъкани[2,3].

Въз основа на различия в химичния състав на капсулните полизахаридни антигени, вида N.meningitidis се разделя на следните серогрупи: A, B, C, D, X, Y, Z, W135, 29E, H, I, K, L. С инвазивните менингококови инфекции най-често са свързани 6 серогрупи, а именно – A, B, C, X, Y, W[4].

Серогрупи А, В и С са най-честите причинители на менингококов менингит[4] . У нас, както и в Европа, серогрупи B и C са основни причини за

инвазивната менингококова болест[5]. По-голямата част от това заболяване в европейските страни и честотата, с която варира от 0.2 до 14 случая на 100 000[5], е причинена от щама на серогрупа В, особено в страни, в които има въведена менингококова конюгирана ваксина за серогрупа C. В последно време се докладва увеличение на менингококовите серогрупи W и Y[6,7]. Серогрупа B е определена като водеща причина за менингококова болест в Тайланд и Тайван[5]. Също така N. meningitidis серогрупи A, C, X, и Y са били идентифицирани в азиатските страни[5,8,9].

Клиниката на бактериалния менингит е с остро начало. Наблюдава се силно главоболие, повръщане, повишена температура до 38-40°С с втрисане. Развива се и синдром на менингорадикулерното дразнене с хиперестезия и вратна ригидност. За доказване на диагнозата е необходимо извършването на лумбална пункция. При нея в случаите с менингококов менингит, често ликворът изтича под повишено налягане.

Конвенционалните методи, които се използват за идентификация на N. meningitidis включват: оцветяване по Грам, посявка върху хранителни среди, биохимични изследвания, латекс аглутинация за определяне на серогрупите[10,11]. Необходима е бърза микробиологична диагноза за да се установи причинителя.

Защо конвенционалните микробиологични методи за диагностика могат да се провалят в някои от тези случаи? Микроскопските, културелните, биохимичните и латексаглутинационните тестове могат да бъдат субективни и не точни, поради това, че микроорганизмите може да са в изключително малко количество, както и да са не жизнеспособни[12,13].

Директната микроскопия е бърз скринингов метод, но чрез него е възможно да не бъде доказан етиологичен агент или причинителят да бъде объркан с друг. Ясно е, че микроскопските изследвания на организмите могат да бъдат подвеждащи и заключенията повлияни от субективно тълкуване на микроскопските препарати.

Микробиологичната посявка е бавен метод и отрицателния резултат от нея може да бъде в резултат на употребата на антибиотици преди посявка на ликвора, поради това, че бързото започване на антибиотично лечение е от първостепенно значение. Това не е необичайно, особено когато лумбалната пункция се забави. Има случаи на бактериален менингит, в които културелните методи не довеждат до резултат, дори и без включване на антибиотици, поради твърде високата взискателност на този микроорганизъм към условията на култивиране. Това е още едно доказателство за ограниченията на тези методи в микробиологията. Латекс аглутинационните тестове също понякога дават фалшиво отрицателни резултати.

Към настоящия момент, най-бърза и точна микробиологична диагностика може да се проведе с молекулярните методи, чрез полимеразно-верижна реакция в реално време (Real Time-PCR). При тях резултатът може да се получи още на втория час от вземане на материала. Това е много важно за бързото и правилно лечение на бактериалния менингит, особено в детска възраст. Прогнозата е добра при бързо проведена диагностика на причинителя и съответно при провеждане на правилно навременно лечение. За разлика от посявката, PCR не изисква жизнеспособни бактерии. Освен това открива минимално количество бактерии в клинични проби; бактериалният товар в цереброспиналната течност на пациенти варира от 3x10¹ до 4x109 CFU/ml[14,15]. Real Time-PCR е доказано, че открива наличие на менингококова инфекция само с 8 менингококови генома на реакция[16,12] и резултатите се получават в рамките на 2 до 3 часа след вземане на материала от болния.

За идентификация на N. meningitidis към настоящия момент надеждно могат да се ползват два таргетни гена – ctrA и sodC. Генът на капсулния транспортен белтък на клетъчната повърхност – ctrA се отличава с висока консервативност[17]. Този ген е разположен вътре в локуса на капсулата. При около 16% от менингококите липсва интактен ctrA ген[18-20]. Гена sodC е ген за супероксиддисмутазата, който не е генетично свързан с локуса на капсулата и позволява да се идентифицират не само капсулните N.meningitidis. Смята се, че генът sodC при N. meningitidis е получен чрез хоризонтален трансфер от Haemophilus influenzae[21]. Този маркерен ген се съдържа във всички менингококи и няма съобщения за такива при които той липсва. Същевременно е доказано, че sodC не се намира в други Neisseria Spp[22,23].

 
Материали и методи

Клиничните материали, използвани в това проучване са били изпратени от болниците за откриване на етиологичния причинител, като част от референтната лабораторна дейност в НЦЗПБ. Изследваните проби от цереброспинална течност са от пациенти с менингит. Изпратени за изследване са 245 материала, от 2013 г. до 2019 г. Пробите се разделяха на две, като едната се култивира, а от другата се изолира ДНК и се изследва чрез Real Time-PCR. Критерий за изпращане на проби за изследване е пациентите да отговарят на определението за гноен менингит [левкоцитоза (>100 клетки/mm3) и/или повишен протеин (>100 mg/dl ) или намалена глюкоза (<40 mg/dl)]. Пробите, които са били културелно-негативни и Real Time-PCR позитивни са изпратени на НЦЗПБ от болниците, като преди пункцията е приет антибиотик или са транспортирани по-продължително време. През периода от януари 2013 г. до януари 2019 г. бяха изследвани 245 клинични проби за откриване или потвърждаване на бактериален менингит като етиология. За видова идентификация на N. meningitidis и за определяне на серотиповете на N. meningitidis сме използвали Real Time-PCR. Това е високо чувствителен метод, позволяващ да се определят до 10 копия ДНК в проба клиничен материал.

Пробите са изследвани в НРЛ по молекулярна микробиология на НЦЗПБ, България.

  
Резултати

В настоящата статия са представени резултатите от проведено изследване за бактериалните менингити на 245 пациенти. Резултатите от проведеното проучване за периода на трите години са представени в Табл. 1.

Таблица 1: Положителните резултати за N. meningitidis, разпределени по възрастови групи

Положителните резултати за N. meningitidis,
разпределени по възрастови групи

под 1 г. брой

1-4 г. брой

5-9 г. брой

10-19 г. брой

над 20 г. брой

Общо

2013 г.

3

1

1

2

5

12

2014 г.

2

3

1

0

5

11

2015 г.

1

0

3

3

3

10

2016 г.

1

5

1

0

2

9

2017 г.

1

0

1

0

1

3

2018 г.

2

1

2

1

1

7

Общо

10

10

9

6

17

52

  

След провеждане на анализите за идентификация и типизиране на получените ликвори чрез Real Time-PCR бяха получени данни за 52 бактериални менингита, причинени от N. meningitidis при пациенти на възраст от 2 месеца до 83 години. Останалите 193 са отрицателни, като те са причинени от други етиологични причинители.

На Табл. 2 са представени положителните резултати за N. meningitidis, които са типизирани чрез молекулярната техника Real Time PCR. Те са разпределени по серогрупи, а също така и по възрастови групи и по години на постъпване на материалите за изследване.

Таблица 2: Резултати от серотипизиране на положителните N. meningitidis

година

Под 1 г. брой-група

1-4 г. брой-група

5-9 г.

брой-група

10-19 г. брой-група

20 г. и нагоре

брой-група

2013 г.

1-C 3-B

1-B

1-B

2-B

5-B

2014 г.

1-C   1-B

3-B

1-B

0

5-B

2015 г.

1-W

0

2-C 1-B

3-C

1-Y 2-B

2016 г.

1-B

4-C 1-B

1-C

0

1-C 1-B

2017 г.

1-C

0

1-C

0

1-B

2018 г.

1-B 1-W

1-C

1-C 1-B

1-C

1-Y

  

На Фиг. 1 е показано възрастовото разпределение на положителните за N. meningitidis по години. От графиката е видно, че инвазивната менингококова болест е най-често срещана при младите възрастови групи.

Фигруа 1: Графично разпределение на положителните случаи през годините по възрастови групи

    
Заключение

Откриването на N. meningitidis чрез културелен метод е 100% специфично, но методът е ограничен от ниска чувствителност[25,26] и времето от 24-тия до 72-рия час  – необходим период на инкубация. Бързината, чувствителността и специфичността на Real Time-PCR прави този анализ един от предпочитаните методи за откриване на N. meningitidis в клинични проби от референтните лаборатории[27-32].

В много лаборатории ctrA се използва като целеви ген за Real Time-PCR за откриване на N. meningitidis[12,32-35]. Предвид факта че ctrA не присъства в 16% или повече от изолатите[36,37], този ген е подходящо да се използва в комбинация с таргетния ген sodC. Наскоро беше докладвано за генериране на фалшиво отрицателни резултати при ctrA, базирани Real Time-PCR, дължащи се на вариации на последователността в ctrA[38].

Условията на протичане на реакцията, използвани за идентификация на N. meningitidis са същите като тези, използвани за типизиране на серогрупите на N. meningitidis – А, В, С, W, X, и Y(37), което го прави удобен за извършване на едновременно определяне на изолати за идентификация и типиране на менингококите в една 96 ямкова плака.

В обобщение, Real Time-PCR е изключително бърз, чувствителен и специфичен метод. Този метод за диагностика може да се ползва за потвърждаване на изолати и тяхната идентификация, както и за бърза детекция на менингококи в клинични материали, независимо от това дали пациентът е приел еднократно антибиотик.

Възникването на случаи от менингококов менингит у нас и другите страни от Европа показва, че менингококите продължават да бъдат сред водещите причинители на бактериален менингит в света. Менингококите на серогрупа В са признати за едни от основните причинители на бактериални менингити в Европа, а също така и в България[39,40]. През последните години се наблюдава повишаване на случаите от серогрупа С, W и Y.
 

  
 
 
книгопис:
1.    McIntyre, Peter B., Katherine L. O'Brien, Brian Greenwood, and Diederik Van De Beek. "Effect of Vaccines on Bacterial Meningitis Worldwide." The Lancet 380 (2012): 1703-711.
2.    Chaudhuri, A. "Adjunctive Dexamethasone Treatment in Acute Bacterial Meningitis." The Lancet Neurology 3.1 (2004): 54-62. Print
3.    "Neisseria Meningitidis." Microbe Wiki. N.p., n.d. Web. 8 May 2013.
4.    "Pharmainfo.net." A Comprehensive Review on Meningococcal Meningitis. Web. 07 May 2013.
5.    Harrison, L. H., Trotter, C. L., and Ramsay, M. E. (2009). Global epidemiology of meningococcal disease. Vaccine 27(Suppl. 2), B51–B63. doi: 10.1016/j.vaccine.2009.04.063.
6.    Campbell, H., Borrow, R., Salisbury, D., and Miller, E. (2009). Meningococcal C conjugate vaccine: the experience in England and Wales. Vaccine 27(Suppl. 2), B20–B29. doi: 10.1016/j.vaccine.2009.04.067.
7.    Ladhani, S. N., Flood, J. S., Ramsay, M. E., Campbell, H., Gray, S. J., Kaczmarski, E. B., et al. (2012). Invasive meningococcal disease in England and Wales: implications for the introduction of new vaccines. Vaccine 30, 3710–3716. doi: 10.1016/j.vaccine.2012.03.011.
8.    Stephens, D. S., Greenwood, B., and Brandtzaeg, P. (2007). Epidemic meningitis, meningococcaemia, and Neisseria meningitidis. Lancet 369, 2196–2210. doi: 10.1016/S0140-6736(07)61016-2.
9.    Kim, S. A., Kim, D. W., Dong, B. Q., Kim, J. S., Anh, D. D., and Kilgore, P. E. (2012b). An expanded age range for meningococcal meningitis: molecular diagnostic evidence from population-based surveillance in Asia. BMC Infect. Dis. 12:310. doi: 10.1186/1471-2334-12-310.
10.     Janda WM, Gaydos CA (2007) Neisseria. In: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA, editors. Manual of clinical microbiology. Washington, D.C.: ASM Press. pp. 601–620.
11.     Popovic T, Ajello G, Facklam R (1999) Laboratory manual for the diagnosis of meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae. Geneva: World Health Organization. 98 p.
12.    Mothershed EA, Sacchi CT, Whitney AM, Barnett GA, Ajello GW, et al. (2004) Use of real-time PCR to resolve slide agglutination discrepancies in serogroup identification of Neisseria meningitidis. J Clin Microbiol 42: 320–328.
13.    van der Ende A, Schuurman IG, Hopman CT, Fijen CA, Dankert J (1995) Comparison of commercial diagnostic tests for identification of serogroup antigens of Neisseria meningitidis. J Clin Microbiol 33: 3326–3327.
14.    Bingen E, Lambert-Zechovsky N, Mariani-Kurkdjian P, Doit C, Aujard Y, et al. (1990) Bacterial counts in cerebrospinal fluid of children with meningitis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 9: 278–281.
15.     La Scolea LJ Jr, Dryja D (1984) Quantitation of bacteria in cerebrospinal fluid and blood of children with meningitis and its diagnostic significance. J Clin Microbiol 19: 187–190.
16.     Jordens JZ, Heckels JE (2005) A novel porA-based real-time PCR for detection of meningococcal carriage. J Med Microbiol 54: 463–466.
17.     Mothershed, E. A. Use of real-time PCR to resolve slide agglutination discrepancies in serogroup identification of Neisseria meningitidis/ E.A. Mothershed, C. T. Sacchi, A. M. Whitney, G. A. Barnett, G. W. Ajello, S. Schmink, L. W. Mayer, M. Phelan, T. H. Taylor, Jr., S. A. Bernhardt, N. E. Rosenstein, T. Popovic. // Journal of Clinical Microbiology. – 2004. – Vol. 42. – P.320-328.
18.    Claus, H. Molecular divergence of the sia locus in different serogroups of Neisseria meningitidis expressing polysialic acid capsules / H. Claus, M. Vogel , M. Muhlenhoff , R. Gerardy-Schahn , and M. Frosch //Molecular and General Genetics. – 1997.- Vol. 257. – P. 28-34.
19.     Dolan-Livengood, J. M Genetic basis for nongroupable Neisseria meningitidis / J.M. Dolan-Livengood , Y.K. Miller., L.E. Martin, R. Urwin, D.S.Stephens. // Journal of Infectious Diseases. – 2003. –Vol. 187. – P. 1616-1628. 105.
20.    Sadler, F. Genetic analysis of capsular status of meningococcal carrier isolates / . F.A. Sadler, A. Fox, K. Neal, M. Dawson, K. Cartwright, R. Borrow// Epidemiology and Infection. – 2003.- Vol. 130. – P. 59-70.
21.    Kroll JS, Wilks KE, Farrant JL, Langford PR (1998) Natural genetic exchange between Haemophilus and Neisseria: intergeneric transfer of chromosomal genes between major human pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A 95: 12381–12385.
22.     Wilks KE, Dunn KL, Farrant JL, Reddin KM, Gorringe AR, et al. (1998) Periplasmic superoxide dismutase in meningococcal pathogenicity. Infect Immun 66: 213–217.
23.    Benson DA, Karsch-Mizrachi I, Lipman DJ, Ostell J, Sayers EW (2009) GenBank. Nucleic Acids Res 37: D26–31.
24.    WHO MANUAL, 2ND EDITION. Laboratory Methods for the Diagnosis of Men-ingitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenza / WHO/IVB.11.09.-2011, 311 p.
25.    Centers for Disease Control and Prevention (2009) Pediatric bacterial meningitis surveillance – African region, 2002–2008. Morb Mortal Wkly Rep 58: 493–497.
26.    Gurley ES, Hossain MJ, Montgomery SP, Petersen LR, Sejvar JJ, et al. (2009) Etiologies of bacterial meningitis in Bangladesh: results from a hospital-based study. Am J Trop Med Hyg 81: 475–483.
27.    Chiba N, Murayama SY, Morozumi M, Nakayama E, Okada T, et al. (2009) Rapid detection of eight causative pathogens for the diagnosis of bacterial meningitis by real-time PCR. J Infect Chemother 15: 92–98.
28.    Deutch S, Moller JK, Ostergaard L (2008) Combined assay for two-hour identification of Streptococcus pneumoniae and Neisseria meningitidis and concomitant detection of 16S ribosomal DNA in cerebrospinal fluid by real-time PCR. Scand J Infect Dis 40: 607–614.
29.    Hedberg ST, Olcen P, Fredlund H, Molling P (2009) Real-time PCR detection of five prevalent bacteria causing acute meningitis. APMIS 117: 856–860.
30.    Staquet P, Lemee L, Verdier E, Bonmarchand G, Laudenbach V, et al. (2007) Detection of Neisseria meningitidis DNA from skin lesion biopsy using real-time PCR: usefulness in the aetiological diagnosis of purpura fulminans. Intensive Care Med 33: 1168–1172.
31.    Van Gastel E, Bruynseels P, Verstrepen W, Mertens A (2007) Evaluation of a real-time polymerase chain reaction assay for the diagnosis of pneumococcal and meningococcal meningitis in a tertiary care hospital. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 26: 651–653.
32.    Zhu BQ, Xu L, Li MC, Ren HY, Tian GZ, et al. (2008) Establishment and application of TaqMan real-time PCR in detection and serogrouping of Neisseria meningitidis. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi 29: 360–364.
33.    Taha MK, Alonso JM, Cafferkey M, Caugant DA, Clarke SC, et al. (2005) Interlaboratory comparison of PCR-based identification and genogrouping of Neisseria meningitidis. J Clin Microbiol 43: 144–149.
34.    Hedberg ST, Olcen P, Fredlund H, Molling P (2009) Real-time PCR detection of five prevalent bacteria causing acute meningitis. APMIS 117: 856–860.
35.    Jordens JZ, Williams JN, Jones GR, Heckels JE (2002) Detection of meningococcal carriage by culture and PCR of throat swabs and mouth gargles. J Clin Microbiol 40: 75–79.
36.    Claus H, Maiden MC, Maag R, Frosch M, Vogel U (2002) Many carried meningococci lack the genes required for capsule synthesis and transport. Microbiology 148: 1813–1819.
37.    Dolan-Livengood JM, Miller YK, Martin LE, Urwin R, Stephens DS (2003) Genetic basis for nongroupable Neisseria meningitidis. J Infect Dis 187: 1616–1628.
38.    Cavrini F, Liguori G, Andreoli A, Sambri V (2010) Multiple nucleotide substitutions in the Neisseria meningitidis serogroup C ctrA gene cause false-negative detection by real-time PCR. J Clin Microbiol 48: 3016–3018.
39.    V. Levterova, I. Simeonovski, A. Kurchatova, S. Panaiotov, I. Philipova, T. Kantardjiev, Еtiological diagnosis of meningococcal meningitis and serogroup typing of neisseria meningitidis by REAL-TIME PCR in Bulgaria, problems of infectious and parasitic diseases,Volume 44, number 2/2016.
40.    Schwartz BMoore PSBroome CV Global epidemiology of meningococcal disease. Clin Microbiol Rev. 1989;2(suppl)118S- 124S Google Scholar.