Кърмата като източник на бифидобактерии и лактобацили с потенциално приложение в обогатители за кърма и храни за недоносени деца

Съвременните изследвания върху формирането на микробиома показват, че най-голямо въздействие върху състава му през първата година от живота има начинът на раждане, храненето и употребата на антибиотици при кърмачетата[1].

Микробиомът е от решаващо значение за развитието на имунната система, метаболитните функции и потенциалното бъдещо здраве. Има проучвания, показващи специфична роля на чревната микробиота върху генната експресия и неврохимичния метаболизъм. Доказана е модулиращата роля при различни невропсихични разстройства, вкл. депресия, тревожност, болест на Паркинсон, както и при аутизъм[2]. Кърмата е предпочитана храна за новородените, но съставът не винаги покрива нуждите на недоносените деца[3,4].

Недоносените новородени деца с много ниско тегло имат силно ограничени енергийни резерви и оптималното соматично и неврологично развитие зависи от качествената и количествената характеристика на екзогенния енергиен внос. Количеството белтък в майчината и донорската кърма е недостатъчно за осигуряване на оптимален растеж и развитие на мозъка.

Поради това е необходимо тя да бъде обогатявана или да бъдат приложени адаптирани млека с хидролизиран протеин, както и пробиотици[5]. Методите за обогатяване на кърма биват стандартен и индивидуализиран[3]. Проучвания на Oshiro et al.[6] показват, че проблемите в развитието на недоносени деца са свързани с аномалии в чревните микробни съобщества. Установяват, че при обогатяване на коластра или кърма с Bifidobacterium breve се създава полезен микробиомен профил, водещ към благоприятни метаболитни отговори.

На пазара има изобилие от пробиотични продукти за деца и възрастни. Дискусионно е приложението на пробиотици при недоносени деца, тъй като реакцията на тази категория деца към пробиотиците не е както е при доносените. Недоносените деца са изложени на повишен риск от развитие на некротизиращ ентероколит поради нарушения в микрофлората. Според Слънчева най-проученият щам пробиотични бифидобактерии, който може да се прилага и при недоносени деца с тегло от 1000-1500 g, е Bifidobacterium animalis ssp. lactis ВВ-12[7].

Щамът оказва положително влияние върху храносмилателната, респираторната и имунната системи, здравето на кожата, както и прекомерния плач при деца[8,9].
При прием на пробиотичен препарат, съдържащ B. lactis, L. acidophilus, S. thermophilus, витамини, пребиотик и др., от доносени и недоносени деца Р. Георгиева и В. Симов[10] установяват: тенденция към намаляване на случаите на късен неонатален сепсис; негативиране на чревна колонизация с K. pneumoniae (R); значимо намаляване на колонизацията с C. albicans; много добра поносимост без реги­стрирани нежелани ефекти; липсват случаи на инфекции с пробиотичните бактерии.

Според Р. Георгиева[11] пробиотичен препарат, съдържащ L. rhamnosus, L. acidophilus и L. reuteri намира приложение при: новородени деца с цезарово сечение; след приложение на антибиотици; намаляване на колонизацията на чревния тракт с потенциално патогенни микроорганизми; остри гастроентерити; превенция на атопичен дерматит; подобряване на храносмилането; както и превенция на некротичен ентероколит при недоносени деца.

Материали и методи
Проби кърма от седемнадесет здрави дарителки бяха осигурени от БАНКА за МАЙЧИНА КЪРМА. Изолирането и изброяването на бифидобактериите е извършено чрез посяването на десетократни разреждания от пробите върху Beerens агар[12]. За изолиране на лактобацили бяха правени посевки върху de man, Rogosa, Sharpe агар (M.R.S. агар, OXOID). Култивирането се извърши в анаеробна среда (Anaerogen AN 0035A, OXOID). Чисти култури са получени чрез неколкократно субкултивиране в бульонни хранителни среди, разсяване върху Beerens/M.R.S. агар и последващо изолиране на единични колонии.

Идентифицирането на бифидобактериите е извършено посредством родовоспецифичен PCR[13] и секвениране на 16S-rDNA[14]. Междущамовото им разграничаване е извършено с RAPD[15] и PFGE[16]. Лактобацилите са идентифицирани въз основа на физиологични таксономични характеристики, ферментация на въглехидрати (Api 50 CHL, bioMerieux) съгласно изискванията на Bergey’s Mannual[17] и секвениране на 16S-rDNA.

Антибиотичен толеранс е изслед­ван с диагностични набори CMV3AGPF, CMV4AGPF и GPALL1F (Ther­mo Scien­ti­fic) чрез установяване на минималните инхибиращи концентрации на антибиотици по отношение на изолираните култури.

Резултати и обсъждане
Установихме Bifidobacterium spp. в 23.5% от пробите със средна численост 3.6 (2.9÷3.8) log10 cfu/ml. Чрез минимум трикратно реизолиране бяха получени петдесет и пет чисти култури с потвърдена родова принадлежност към бифидобактериите. След групирането на получените изо­лати според техния RAPD профил, представители на различните генотипове бяха идентифицирани до ниво вид/подвид посредством секвениране на 16S-rDNA. Установени бяха представители на: Bifidobacterium ani­ma­lis ssp. lactis; Bifidobacterium bifidum; Bi­fidobacterium longum ssp. infantis и Bi­fi­dobacterium longum ssp. longum.

Иден­тичността на отделните щамове беше допълнително потвърдена чрез генотипиране с PFGE.

L. gasseri беше изолиран от 11.8% от пробите. Изолатите бяха сведени до три разграничаващи се щама. В изследваните проби кърма не беше установено присъствието на други видове лактобацили.

Числеността на лактобацилите и бифидобактериите в кърмата е значително по-ниска, отколкото във фецеса и зависи от много фактори, вкл. националност, регион и др. Soto et al.[18] изследват сто и шестдесет проби кърма. Изолират Lactobacillus от ~41%, a Bifidobacterium spp. от ~11% от пробите с численост – 1.11 (0.99÷1.23) log10 cfu/ml на лактобацилите и 0.96 (0.76÷1.16) log10 cfu/ml на бифидобактериите. Solis et al.[19] установяват по-висока численост на бифидобактерии в кърмата на двадесет изследвани доброволки ~3.7 log10 cfu/ml, стойност до която са по-близки получените от нас резултати.

Не изолирахме представители на B. adolescentis, който някои автори свързват с атопичен дерматит и алергии[20].

За да се предотврати нежелано прехвърляне на резистентност към ендогенни бактерии, пробиотичните бактерии трябва да преминат през допълнителна проверка, че не носят придобити преносими гени за антибиотична устойчивост. Резултатите от определянето на минималните инхибиращи концeнтрации (MIC) на различните антибиотици при тестваните щамове L. gasseri са представени в Таблица 1.

Съпоставката с праговите инхибиращи концентрации, дефинирани от EFSA[21], над които проучвана култура може да се счита за резистентна показа, че трите щама надвишават препоръчваните стойности за MIC на канамицин, два щама надвишават препоръчаните стойности за ванкомицин, а един щам – за гентамицин. Известно е, че лактобацилите притежават естествена, нетрансферируема резистентност спрямо широк спектър от антибиотици, която не представлява заплаха за безопасната им употреба[22]. Например, един от най-широко разпро­странените пробиотични щамове L. rhamnosus GG e резистентен към ванкомицин, но тази устойчивост не може да се предава на други микроорганизми[23]. При изолираните от нас култури L. gasseri съгласно препоръките на EFSA, ще е необходимо провеждането на генетични тестове за доказване отсъствието на трансферируеми гени за антибиотична резистентност по отношение на антибиотиците ванкомицин, канамицин и гентамицин (Табл. 1).

В Таблица 2 са представени данните за MIC за проучваните бифидобактерии. Превишаване на праговите стойности, указани от EFSA, установихме при изолирания от нас B. animalis ssp. lactis за гентамицин и стрептомицин, при B. bifidum за гентамицин, а при B. longum ssp. longum – за ампицилин. Според Duranti et al.[24] само малка част (~1.0%) от гените, отговарящи за антибиотичната ре­зистентност в род Bifidobacterium се намират в мобилни елементи, които могат да улеснят трансфера им към други бактерии. Независимо от това, ще са необходими допълнителни генетични изследвания при тези култури за доказване отсъствието на преносими гени за резистентност към съответните антибиотици. Изо­лираните от нас два щама (B. longum ssp. longum и B. longum ssp. infantis) в най-голяма степен се доближават до праговите стойности, дефинирани от EFSA и са подходящи за последващи изследвания за разработване на пробиотичен препарат.

Приложението на пробиотични бактерии с повишена вродена устойчивост към определени антибиотици може да е желан фактор при подбора на пробиотични кандидати, съпътстващи антибиотична терапия (Табл. 2).

Заключение
В резултат на настоящето проучване от кърма бяха изолирани бифидобактерии от видовете B. animalis ssp. lactis, B. bifidum, B. longum ssp. infantis и B. longum ssp. longum, както и лактобацили от вида L. gasseri с потенциал за приложение при хранене на недоносени деца.
Предвид влиянието на микроорганизмите върху здравния статус и спецификата при храненето на недоносени деца, обогатяването на кърмата или на специализираните храни с полезни бактерии, би допринесло за профилактика и лечение на някои заболявания, в това число такива, изискващи антибиотична терапия, както и при превенция на некротизиращ ентероколит.

Ефективността на такива обогатяващи добавки може да се повиши чрез прилагането на индивидуализиран подход. Центърът за научноизследователска и развойна дейност и Акредитираната лаборатория за изпитване на храни при „Ел Би Булгарикум” ЕАД разполагат с капацитет и съвременна апаратура за оценка наличието на лактобацили, бифидобактерии и други микроорганизми, както и физикохимичен анализ на кърма, с което може да улесни лекарите педиатри при прилагане на индивидуализиран подход при храненето както на недоносени деца, така и на деца в кърмаческа възраст.

книгопис:

1. O’Neill J., R. Gallardo, R. Saldova, E. Murphy, P. Cotter, F. McAuliffe Maternal and infant factors that shape neonatal gut colonization by bacteria. Expert Review of Gastroenterology&Hepatology,Volume 14, 2020, Issue 8, pр. 651-664.
2. https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/17474124.2020.1784725
3. Warner B. The contribution of the gut microbiome to neurodevelopment and neuropsychiatric disorders. Pediatr Res 85, 216–224 (2019). https://www.nature.com/articles/s41390-018-0191-9
4. Томова В., Р. Георгиева „Съвременни стратегии за хранене на недоносени деца” „Практическа Педиатрия”, Брой 7/2015.
5. Вакрилова, Л. (2016) „Хранене на рискови недоносени деца”, „Практическа педиатрия” https://prakticheska-pediatria.net/2016/08/24/parenteral-nutrition/
6. Георгиева Р. „Хранене на недоносените деца с ниско тегло” МЕДИНФО, Брой 2/2014 https://www.medinfo.bg/spisanie/2014/2/statii/hranene-na-nedonosenite-deca-s-nisko-teglo-1632
7. Oshiro, T., S. Nagata, H. Tsuji, T. Asahara, Ch. Wang, T. Takahashi et аl Bifidobacterium Supplementation of Colostrum and Breast Milk Enhances Weight Gain and Metabolic Responses
8. Associated with Microbiota Establishment in Very-Preterm Infants. Biomed Hub, 2019, 4:502935, DOI:10.1159/000502935 https://www.karger.com/Article/FullText/502935
   Слънчева Б. „Мястото на пробиотиците в лечението на недоносени деца”, „Здравен навигатор”, BG1811924871/20-NOV-2018.
9. http://medicalnews.bg/zdraven/2018/11/21/myasto-na-probiotitsite-v-lechenieto-na-nedonoseni-novorodeni/
   Bifidobacterium, BB-12® The words most documented Bifidobacterium
10. https://www.chr-hansen.com/en/probiotic-supplements-and-infant-formula/our-probiotic-strains/bifidobacterium-animalis-subsp-lactis-bb-12
11. The Science behind Bifidobacterium BB-12® (2013) Mikkel Jungersen MSc, Published by Department of Scientific Affairs Human Health&Nutrition https://nancysyogurt.com/wp-content/uploads/2017/08/The-science-behind-BB-12.pdf
12. Георгиева Р., В. Симов „Пробиотици в неонаталния период. Приложение на Bio Balance Baby при доносени и недоносени новородени деца”, „Педиатрия”, Брой 1/2014, стр. 65-69
13. Георгиева Р. „Пробиотци при новородени деца и кърмачета. Ефективност на комбинация от лактобацили, използвана в пробиотичния препарат ProCombo baby”, МЕДИНФО, Брой 8/2019
14. Beerens H., An elective and selective isolation medium for Bifidobacterium spp. Letters in Applied Microbiology, Vol.11, Issue3, September 1990, рp. 155-157 https://doi.org/10.1111/j.1472-765X.1990.tb00148.x
15. Venema K, Maathuis AJH, A PCR-based method for identification of bifidobacteria from the human alimentary tract at the species level. FEMS Microbiology Letters, Vol. 224, Issue 1, July 2003, рp. 143–149, https://doi.org/10.1016/S0378-1097(03)00436-1
16. Sakata S., Ryu S., Kitahara M., Sakamoto M., Hayashi, H. Fukuyama, M. and Benno Y. Characterization of the Genus Bifidobacterium by Automated Ribotyping and 16S rRNA Gene
17. Sequences. Microbiology and Immunology, 2006, 50:1-10. https://doi.org/10.1111/j.1348-0421.2006.tb03762.x
18. Krízová J., А. Spanová, В. Rittich RAPD and rep-PCR fingerprinting for characterization of Bifidobacterium species. Folia Microbiol (Praha), 2008, 53(2):99-104. doi: 10.1007/s12223-008-0014-1. Epub 2008 May 25, PMID: 18500627.
19. Mättö J., E. Malinen, M. Suihko, M. Alander, A. Palva and M. Saarela Genetic heterogeneity and functional properties of intestinal bifidobacteria. Journal of Applied Microbiology, 2004, 97:459-470 https://sfamjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2672.2004.02340.x
20. Bergey’s Mannual 2009, ISBN: 978-0-387-95041-9, DOI: 10.1007/b92997
21. Soto A., V. Martin, E. Jimenez, I. Mader, J. Rodriguez, and L. Fernandez Lactobacilli and Bifidobacteria in Human Breast Milk: Influence of Antibiotherapy and Other Host and Clinical Factors. HEPATOLOGY AND NUTRITION, 2014, Vol. 59(1), pp.78-88
22. Solís G., C. de Los Reyes-Gavilan, N. Fernández, A. Margolles, M. Gueimonde Establishment and development of lactic acid bacteria and bifidobacteria microbiota in breast-milk and the infant gut. Anaerobe, 2010 Jun; 16(3):307-10. https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1075996410000235
23. Grönlund M., M. Gueimonde, K. Laitinen et al Maternal breast‐milk and intestinal bifidobacteria guide the compositional development of the Bifidobacterium microbiota in infants at risk of allergic disease. Clinical&Experimental ALLERGY, 2007, Vol. 37(12), pp. 1764-1772 https://doi.org/10.1111/j.1365-2222.2007.02849.x
24. Guidance on the characterisation of microorganisms used as feed additives or as production organisms EFSA Journal 2018; 16(3):5206 https://efsa.onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.2903/j.efsa.2018.5206
25. Ashraf R. and Shah N. P. Review Article Antibiotic resistance of probiotic organisms and safety of probiotic dairy products. International Food Research Journal 18(3): 837-853 (2011)
26. Tynkkynen S., K. Singh, P. Varmanen Vancomycin resistance factor of Lactobacillus rhamnosus GG in relation to enterococcal vancomycin resistance (van) genes. Int. J. Food Microbiol. 1998 Jun 16; 41(3):195-204. doi: 10.1016/s0168-1605(98)00051-8.
27. Duranti S., G. Lugli, L. Mancabelli, Fr. Turroni, Chr. Milani, M. Mangifesta et al Prevalence of Antibiotic Resistance Genes among Human Gut-Derived Bifidobacteria. Applied and Environmental Microbiology, February 2017, Vol. 83, Issue 3 e02894-16.