Серозен отит с излив. Eтиологична роля на Alloiococcus otitidis

Увод
Серозният отит с излив представлява натрупване на течност в кухините на средното ухо зад интактна тъпанчева мембрана, без симптоми или белези на остра инфекция. Важността му произтича от широкото разпространение в детската възраст – 2/3 от децата до 3-годишна възраст имат поне един епизод на серозен отит с излив[1].

Честотата му е особено висока (между 60-85%) при различни краниофациални малформации, най-вече тризомия 21 и вродени цепки на небцето. Персистиращият серозен отит с излив води до намаление на слуха от звукопроводен тип и увреда на тъпанчевата мембрана (атрофия, ретракционни джобове, дори холестеатом). Засягането на слуховата функция може да бъде последвано от забавяне на речевото развитие и поведенчески прояви[2].

Етиопатогенеза
Заболяването за пръв път е описано от Politzer през 1867 г., който заедно със Zaufal и Berzhold предлагат теорията hydrops ex vacuo. Според тях ранно събитие в патогенезата на хроничния серозен отит с излив е механичната обструкция на Ев­стахиевата тръба, с последваща абсорбция на газовете в средното ухо. Това предизвиква негативно налягане в средното ухо, водещо до образуването на трансудат.

Тази теория има някои недостатъци, тъй като течността в средното ухо е активно секретиранa и се касае всъщност не за трансудат, а за ексудат, откъдето впоследствие идва и наименованието ексудативен отит. Освен това Tos и Pеdersen установяват епителна метаплазия в лигавицата на средното ухо, с последваща колекция на мукозен или серомукозен секрет, но не и гноен[2]. През 1976 г. Mawson дефинира това състояние като Otitis Media with Effusion (OME) – наличие на течност в кухините на средното ухо и липса на белези на остра инфекция[2].

Смята се, че серозният отит с излив е мултифакторно заболяване, като развитието му се повлиява от индивидуални особености и фактори на околната среда. Комбинацията от тези фактори допринася за дисфункция на Евстахиевата тръба, но тя сама по себе си обикновено не е достатъчна, за да причини серозен отит с излив. През последните десетилетия се натрупва все повече данни, че инфекциозни или други имунологични процеси също могат да предизвикат началната фаза на този процес.

Инфекциите на ГДП могат да доведат до остър гноен отит, а впоследствие да се развие и серозен отит с излив. Понастоящем се увеличава броят на студията, доказващи бактериални причинители в секрета от средно ухо на пациенти със серозен отит.

Проучване на Bluestone et al. установява, че най-честите патогени в средното ухо са Strеptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae и Moraxella catarrhalis. Авторите обаче откриват различен процент от тези бактерии при остър среден отит и серозен отит с излив.

При острия гноен отит най-често срещаната бактерия е S. pneumoniae, изолирана в 35% от случаите, докато при серозния отит с излив е открита само в 7% от случаите. Обратно, при серозния отит с излив най-често изолираната бактерия е H. influenzae (15% от ексудатите), а втора по честота е M. catarrhalis, култивирана в 10% от ексудатите.

Това проучване е проведено чрез микробиологично изследване на 7369 ексудата от средно ухо, от които 4589 са на пациенти със серозен отит с излив и често е модел за други изследователи. Bluestone не е установил бактериален растеж в 30% от пробите, а в 45% са идентифицирани непатогенни микроорганизми[3].

В миналото, идентифицирането на бактерии в ексудат от средно ухо при серозен отит с излив е било ограничено и много автори са смятали, че секретът е стерилен. След въвеждането в практиката на полимеразната верижна реакция (PCR) и 16S rRNA секвенирането, бактерии се срещат почти универсално в изследваните аспирати[4].

Установяването на бактерии чрез PCR предполага бактериална етиология на серозния отит. Palmu et al. идентифицира S. pneumoniae в 47.1% от излива в средното ухо с помощта на PCR, сравнено с 27.3% при използване на стандартни микробиологични култури.

В проучване на Park et al. бактерии в културите са открити при 14% от случаите, а при използване на PCR техника е изолирана бактериална ДНК в 36.7%. Niedzielski et al. съобщават съответно за 38.38% и 61.62%[1]. Тази разлика в ограниченото изолиране на бактерии в микробиологичните култури се обяснява със специфичната природа на бактериите и техните изисквания за растеж (растежна среда, атмосферни условия, температура и др.), антибиотична терапия преди дренажа на ухото, наличие на секреторни имуноглобулини и лизозим в секрета на средното ухо, които потискат бактериалния растеж, наличие на бактерии в средното ухо, формиращи биофилми и др.[1]

Освен основните три отопатогена (S. pneumoniae, H. influenzae и M. catarrhalis) все по-често се установяват и други микроорганизми в секрета от средно ухо при серозния отит с излив.

През 1989 г. Faden et al. изолират неизвестен дотогава грам-положителен аеробен бактерий от секрет от средно ухо на десет деца със серозен отит. Новооткритите коки се характеризират с бавен растеж, с малки алфа-хемолитични колонии, развиващи се на 3-4-ти ден при култивиране на кръвен агар.

Често са представени като диплококи или тетради, каталаза позитивни и оксидаза негативни[5]. През 1992 г. е анализирана последователността на 16S rRNA на новия микрооргани­зъм и той е определен като отделен вид – Alloiococcus otitis („различен кокус“) от Aguirre и Collins.

На следващата година номенклатурата е ревизирана и е преименувана на Alloiococcus otitidis[6]. Този микроорганизъм е трудно да бъде доказан в секрета от средното ухо чрез конвенционалния метод – микробиологично изследване, защото показва бавно in vitro развитие, изисква удължено време за инкубация и образува малки колонии.

При откриването си е бил успешно култивиран при 37°С с 5% CO2 върху кръвен агар за 2-5 дни[5]. Впоследствие само шест автори са докладвали за изолирането на A. otitidis от микробиологична култура до 2007 г., когато Ashhurst-Smith et al. успяват да култивират A. otitidis, използвайки по-ниска температура 35°С и 7.5% CO2 и го установяват в 40% от пробите с аспират от пациенти със серозен отит с излив[7].

Поради различните условия на култивиране потенциалът на свръхрастеж на другите микроорганизми, маскиращ наличните малки колонии на A. otitidis, не е ясно дали честотата на изолирането му от микробиологична култура не е съпоставима с тази на трите основни отопатогена. През 1997 г. A. otitidis е включен като част от мултиплекс PCR метод, заедно с трите главни отопатогена[7] и така A. otitidis се оказва най-често срещаният бактериален вид при пациенти със серозен отит с излив – 19-64%[4]. На Таблица 1 са представени резултати от различни авторски колективи.

Разпространение на A. otitidis
Въпреки че A. otitidis е най-разпро­страненият бактериален вид, открит в секрета от средно ухо при пациенти със серозен отит с излив, все още няма консенсус относно ролята му в етиологията на това заболяване.

При първоначалното му откритие A. otititdis е установен вътреклетъчно, което според авторите е индикация за патогенна способност[5]. Впоследствие е бил идентифициран като част от нормалната флора на външния слухов проход, където основните отопатогени рядко се наблюдават. От друга страна почти не се изолира от назофаринкса (0.511%)[4] мястото, което първоначално колонизират основните отопатогени[7]. Не е открит и във vestibulum nasi.

Обичайната находка на А. оtitidis в излива при серозния отит може да се дължи на факта, че е част от нормалната флора на средното ухо или просто да е само фактор, допринасящ за отит в полимикробна флора[7]. Leskinen et al. смятат, че Alloicoccus otitidis може да няма клинична значимост при острия гноен отит, но от друга страна, наличието му при серозния отит с излив е свързано с по-продължително протичане на заболяването.

Те установяват, че при персистиране на ексудата при серозния отит над 3 месеца, значително се увеличават положителните PCR проби за A. otitidis. Това подкрепя възможността A. otitidis да е фактор за удължаване на инфекцията в средното ухо. Освен това авторите забелязват, че ексудатът при пациенти с изолиран A. otitidis, е предимно мукозен, отколкото серозен, което също може да се обясни с преимущественото идентифициране на A. otitidis при протрахиран серозен отит[8].

В контраст, A. otitidis се среща по-рядко при остро възпаление на средното ухо и то преимуществено при рекурентния остър гноен отит 0-50%[7]. Прави впечатление обаче фактът, че при студията, установили по-висока честота на A. otitidis при остър гноен отит, по-голям процент от събраните секрети от средно ухо са след спонтанна перфорация. Това предполага, че бактериите от външния слухов проход преминават през перфорацията в средното ухо и вероятно създават условия за протрахирането на инфекцията[4].

Интересни асоциации в разпространението на A. otitidis и трите отопатогена в секрета от средно ухо на пациенти със серозен отит с излив откриват Leskinen et al. Те установяват A. оtitidis чрез PCR съответно в 17 и 21% от микробиологичните проби, положителни за S. pneumoniae и H. influenzae.

Изненадващо, няма нито една положителна PCR проба на A. otitidis в микробиологична култура, положителна на M. catarrhalis. Използвайки PCR се установява, че относителното разпространение на A. otitidis е многократно по-голямо в полимикробни култури, отколкото в такива с изолиран един микроб, но не и в средите с M. catarrhalis. Дали A. otitidis потиска развитието на M. catarrhalis, е въпрос на бъдещи проучвания[8].

Индукция на имунен отговор
Harimaya et al. предполагат, че A. otittidis има достатъчно имуногенен потенциал не само да моделира имунния отговор на гостоприемникa, подобно на трите главни патогена (S. pneumoniae, H. influenzаe и M. catarrhalis), но и самостоятелно да допринесе за възпалителна реакция в средното ухо[9].

Проучванията in vivo показват, че A. otitidis има имуностимулиращ потенциал върху миелоидни и лимфоидни клетъчни типове[10,11]. Също така е доказано, че индуцира серозен отит с излив при плъхове, макар и в лека форма[12].

Има няколко проучвания, оценяващи способността на A. otitidis за предизвикване на имунен отговор, които доказват патогенния му потенциал. Първоначално се оценява производство на интерлевкини (IL) от THP-1 клетки (IL-8 и IL-12) и Hep-2, HeLa и U937 клетки (IL-8) в отговор на A. otitidis.

Тези проучвания показват, че жизнеспособните A. otitidis са способни да стимулират IL-8 и IL-12 на нива, съпоставими с тези при трите основни отопатогени[10]. Ефектът е по-слабо изразен, когато клетките са стимулирани с цели убити A. otitidis и когато жизнеспособните клетки са предпазени от директен контакт, но разтворимите протеини от A. otitidis предизвикват отговор за двата цитокина[10].

Цели убити A. otitidis могат също да индуцират експресия на CD69, показващо активиране на лимфоцитите в кръвта и аденоидните лимфоцити, на нива сравними с основните отопатогени, но отговорът е по-слаб от този, предизвикан от Staphylococcus aureus[11].

Цял убит А. otitidis също е доказано, че активира сигнални пътища за производството на IL-8, подобно на S. pneumoniae. Ashhurst-Smith et al. oткриват, че убити от формалин клетки от клинични изолати на A. otitidis индуцират IL-1, IL-6, IL-8 и TNF на клетъчна линия in vitro на или над нива, индуцирани от S. pneumoniae. Експерименти с безклетъчни фил­трати от изолати на A. otitidis показват, че извънклетъчните протеини, а не пептидогликанът, могат да бъдат отговорни за индукцията. Производството на проинфламаторни цитокини представя доказателства, че човешката имунна система реагира на A. otitidis[7].

Образуване на биофилм в средното ухо
През 2006 г. Hall-Stoodley et al., използвайки конфокална микроскопия, установяват при 92% от изследваните деца със серозен отит с излив, наличие на живи бактерии (S. pneumoniae, H. influenzaе и M. catarrhalis) в биопсия от лигавица на средно ухо, проведена преди поставяне на вентилационна тръбичка[13]. Тези метаболитно активни бактерии може да присъстват в поне половината от всички случаи на серозен отит с излив със стерилни бактериални култури и се смята, че участват в образуването на биофилм[13].

Използването на 16S rRNA секвениране, потвърждава изследванията на Chan et al., че A. otitidis и H. influenzae са двете най-често срещани бактерии, демонстрирани при деца със серозен отит с излив, и че външният ушен канал може да действа като резервоар за средното ухо. Освен това, филогенетичен анализ от тези проучвания показват обратна връзка в относителното изобилие на A. otitidis и H. influenzae, което предполага потенциал за бактериално взаимодействие[4,9].

A. otitidis е строго аеробен, като неговата жизнеспособност значително намалява при анаеробно отглеждане. Присъствието му в секрета при серозен отит е малко неочаквано, тъй като средата на изпълненото с течност средно ухо се смята, че е хипоксична. Наскоро проведени проучвания от Chan et al. доказват, че A. otitidis образува биофилми в бульонна култура както с H. influenzae, така и самостоятелно. Още повече, A. otitidis подобрява растежа на H. influenzae както в среда без необходимите му фактори V и X, така и при субоптимални температури (до 30°С). Това предполага усилване на продукцията на биофилма от отопатогените[12]. На Фигури 1, 2 и 3 са показани биофилмите, които образува A. otitidis.

фигура 1: Конфокална лазерна сканираща микроскопия (CLSM) на A. оtitidis – плътни сателитни агрегации на A. otitidis в BHIb (A) и по-редки агрегации в BHIs (B) при увеличение Х63. Използвано е оцветяване Live/Dead BacLight Bacterial Viability staining: живи клетки (с непокътнати клетъчни мембрани) оцветени в зелено и мъртви или умиращи клетки (с компрометирани клетъчни мембрани), оцветени в червено[12]

фигура 2: Конфокална лазерна сканираща микроскопия (CLSM) на многовидов биофилм в BHI на A. otitidis и H. influenzae (увеличение Х63 и след оцветяване Live/Dead BacLight Bacterial Viability staining), състоящ се от A. otitidis (зелени коки, обозначени със стрелки) и H. influenzae (смесени, по-малки, оранжево-зелени кокобацили, обозначени със звездички). (A-C) Показаните щамове на H. influenzae са NT 1159 (A),

NT 176 (B) и ATCC 33391 (C)[12]

фигура 3: Сканираща електронна микроскопия (SEM) на A. otitidis и H. influenzae многовидов биофилм.

(А) А. otitidis самостоятелен биофилм в BHIb и (B) многовидов биофилм в BHIs на A. otitidis (коки, показани със стрелки) и H. influenzae (пръчици, показани със звездички)[12]

Показвайки, че A. otitidis образува биофилм, Chan et al. добавят доказателствата, че този вид бактерии може да играе роля в патогенезата на серозния отит с излив. Най-вероятно това заболяване се предизвиква от образуването на биофилми в средното ухо, а способността на A. otitidis да образува биофилм е в съответствие с тази теза[10].

В допълнение, жизненият цикъл на биофил­мите много наподобява естествената еволюция на серозния отит с излив, който се характеризира с често спонтанно отзвучаване, но също и с висока честота на рецидиви и персистиране на бактериите въпреки антибиотичното лечение. Докато са под формата на биофилм, бактериите могат да причинят подостро възпаление и по този начин да се поддържа изливът в средното ухо.

От друга страна, чрез планктонно отделяне от биофилма, те активират възпалителната реакция и възобновяване на острата фаза на инфекцията. Образуването на биофилм в средното ухо осигурява на бактериите възможност за оцеляване и устойчивост в околната среда (напр. колебания в температурата, напрежението на кислорода, pH) и при химични стресори (напр. антибиотици), но също и срещу фагоцитозата и хуморалния имунитет. Бактериите в полимикробните биофилми допълнително засилват тази защита както чрез трансфер на гени за резистентност към антибиотици между щамовете, така и чрез забавяне на метаболизма си[9].

Щамовете A. otitidis са описани като резистентни към триметоприм – сулфаметоксазол, макролиди и ванкомицин и са чувствителни или с междинна устойчивост към пеницилин и ампицилин, цефалоспорини, тетрациклин и флуорохинолони, въпреки че са бета-лактамаза негативни[4,7].

Проучвания върху фармакокинетиката на перорално прилаганите антибиотици за лечение на серозен отит с излив демонстрират, че въпреки достигането на бактерицидна концентрация в средното ухо, бактериите, които образуват биофилми, са стотици пъти по-устойчиви на антибиотици от свободно живеещите (планктонни) бактерии. Това може да се интерпретира с факта, че части на биофилма растат бавно и по-рядко взаимодействат със средата на средното ухо, което пък обяснява клиничната неефективност на антибиотиците при лечение на серозен отит с излив[1].

От друга страна, поставянето на вентилационна тръбичка възстановява вентилацията на средното ухо и причинява повишаване на парциалното налягане на кислорода, което променя фенотипа на биофилма. Аспирацията на ексудата разрушава и намалява масата на биофилма, повишава нивото на кислорода и води до обновяване на цилиарния епител[1]. Хипотезата за образуване на биофилм в средното ухо, също е в съответствие с клиничните наблюдения, че дренажът с вентилация е най-ефективният метод за лечението на серозен отит с излив.

Заключение
Серозният отит с излив е активно хронично бактериално заболяване, а не асептичен възпалителен процес, в което A. otitidis играе роля пряко или косвено. Най-вероятно той е фактор за хронифициране на инфекцията, а образуването на полимикробни биофилми в средното ухо с негово участие обяснява не само хроничното протичане, но и резистентността към консервативното лечение, поради което поставянето на вентилационни тръбички за момента е единствено решение. n

книгопис:
1. Niedzielski A, Chmielik LP, Stankiewicz T. The formation of biofilm and bacteriology in otitis media with effusion in children: A prospective cross-sectional study. International Journal of Environmental Research and Public Health. 2021;18(7).
2. Vanneste P, Page C. Otitis media with effusion in children: Pathophysiology, diagnosis, and treatment. A review. Vol. 14, Journal of Otology. PLA General Hospital Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery; 2019. p. 33–9.
3. BLUESTONE CD, STEPHENSON JS, MARTIN LM. Ten-year review of otitis media pathogens. The Pediatric Infectious Disease Journal. 1992 Aug;11(Supplement):S7-11.
4. Chan CL. The microbiome of otitis media with effusion and the influence of Alloiococcus otitidis on Haemophilus influenzae in polymicrobial biofilm. 2016.
5. Faden1 H, Dryja2 D. Recovery of a Unique Bacterial Organism in Human Middle Ear Fluid and Its Possible Role in Chronic Otitis Media. Vol. 27, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY. 1989.
6. Graevenitz Аlexander von. Revised Nomenclature of Alloiococcus otitis. J CLIN MICROBIOL. 1993;472–472.
7. Lappan R, Jamieson SE, Peacock CS. Reviewing the Pathogenic Potential of the OtitisAssociated Bacteria Alloiococcus otitidis and Turicella otitidis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2020;10(February).
8. Leskinen K, Hendolin P, Virolainen-Julkunen A, Ylikoski J, Jero J. The clinical role of Alloiococcus otitidis in otitis media with effusion [Internet]. Available from: www.elsevier.com/locate/ijporl
9. Harimaya A, Takada R, Hendolin PH, Fujii N, Ylikoski J, Himi T. High incidence of Alloiococcus otitidis in children with otitis media, despite treatment with antibiotics. Journal of Clinical Microbiology. 2006;44(3):946–9.
10. Himi T, Kita H, Mitsuzawa H, Harimaya A, Tarkkanen J, Hendolin P, et al. Effect of Alloiococcus otitidis and three pathogens of otitis media in production of interleukin-12 by human monocyte cell line. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 2000 Oct;29(2):101–6.
11. Tarkkanen J, Carlson P, Himi T, Ylikoski J, Atshushi H, Mattila PS. Stimulation of Adenoidal Lymphocytes by Alloiococcus Otitidis. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 2000 Oct 29;109(10):958–64.
12. Chan CL, Richter K, Wormald PJ, Psaltis AJ, Vreugde S. Alloiococcus otitidis forms multispecies biofilm with Haemophilus influenzae: Effects on antibiotic susceptibility and Growth in Adverse Conditions. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2017 Aug 2;7(AUG).
13. Hall-Stoodley L, Ze Hu F, Gieseke A, Nistico L, Nguyen D, Hayes J, et al. Direct Detection of Bacterial Biofilms on the Middle-Ear Mucosa of Children With Chronic Otitis Media. Vol. 296, JAMA. 2006.
14. Vanneste P, Page C. Otitis media with effusion in children: Pathophysiology, diagnosis, and treatment. A review. Journal of Otology. 2019;14(2):33–9.