CD68 и CD88 експресия в синовиалната тъкан при пациенти с псориатичен артрит

Пациенти и методи: 35 пациенти с диагноза на ПсА бяха включени в настоящото пилотно проучване; от тях всички са с полиартриткуларно периферно и централно засягане (CASPAR-критерии >3, DARSA >14), средната им възраст е 45.12±15.07 год., с давност на заболяването 5.67±3.24 год. Резултатите на болните с ПсА бяха сравнени с резултати на болни, страдащи от гонартроза (n=40), ACR критерии за гонартроза (1991), III-IV степен по скалата на Kellgren-Lawrence. Биологичен материал от синовия на колянни стави, получен по време на операция за смяна на колянна става беше изследван имунохистохимично за експесия на CD68+ и CD88+ в Имунологичната лаборатория на Института по репродуктивна биология при БАН, София и в Катедра по обща и патологична анатомия, Медицински факултет, МУ-Плов­див. От всяка една тъканна проба на болни с псориатичен артрит и гонартроза са направени поне 10 предметни стъкла и са изследвани от хистолог.

Заключения: Резултатите показаха, че в синовиалната тъкан на бол­ните с ПсА се установяват активирани CD68+ и CD88+ клетки, които синтезират високо ниво на ТНФ-а, интерлевкин-17, интерлевкин-22, интерлевкин-23 и определят тежка ставна деструкция в сравнение с болните от гонартроза, което доказва необходимостта от ранна биологична терапия.

Синовиалната мембрана покрива ставната кухина и се състои от тънък слой клетки синовиални фибро­бласти и макрофаги. Под тях има рехава съединителна тъкан с кръвоносни съдове, лимфоидни съдове, фибробласти, нервни влакна и левкоцити[1]. При патологична промяна, свързана с възпалителен ставен процес, в синовията се наблюдава хиперплазия, дължаща се на пролиферация на синовиални фибробласти и натрупване на макрофаги, неоангио­генеза и инфилтрация от имунни клетки, произвеждащи провъзпалителни цитокини[1,2]. Синовитът при псориатичен артрит (ПсA) се характеризира с хиперплазия и повишен брой на фибробластоподобни синовиоцити и макрофаги, хиперваскуларност, наличие на хиперемични вили и субсиновиален инфилтрат от Т-клетки, В-клетки, неутрофили и мастоцити[2]. Наличието на тези клетки в синовиалната мембрана на пациенти с ПсA води до повишена експресия на тумор некрозис фактор-а (TNF-a), интерферон-гама (INF-gamma), интерлевкин (IL)-1B, IL-2, IL-10, IL-17, IL-18, матрични металпротеинази, колонистимулиращи фактори[2,3].

Хистологичната оценка на псориатичния синовиум показва наличието на клонални и неклонални Т-лимфоцити, макрофаги и моноцити[4]. Хистологичното разположение на имунните клетки в синовиалната тъкан при пациенти с ПсA е хетерогенно и включва наличието на ектопични лимфоидни структури. Клъстери от дендритни клетки и Т-лимфни агрегати допринасят за хронифицирането на заболяването[5]. Провъзпалителните цитокини, секретирани от макрофагите (напр. TNF-α, IL-6, IL-17), играят значителна роля в ПсA[5,6]. Неутрофилният компонент, който характеризира синовиума в PsA, наподобява псориатични кожни лезии[5].

Според резултатите от изследването на синовиалната биология при пациенти с възпалителни артрити, тя има поне няколко патологични вида – “лимфоиден” патологичен тип, с преобладаване на лимфоцити в синовиума, “миелоиден” патологичен тип, доминиран от макрофаги, без ясно организирани фоликуларни структури и “фибробен” тип, при който синовиалната тъкан се характеризира с рядка инфилтрация на имунни клетки и богата на фибро­бласти строма[7].

Имунохистохимичният анализ на синовиалната мембрана може да бъдат полезен при оценка на пациенти с псориатичен артрит. Автори са установили, че синовиалната покривка при възпалителни ставни заболявания като ревматоиден артрит и ПсА са достатъчно различни, за да може това изследване да потвърди конкретната диагtноза[8].

CD68 (клъстер от диференциация 68, макросиалин) е гликопротеин от семейството на Dendritic cell – Lysosomal-Associated Membrane Pro­­­­tein (LAMP)[9]. Протеинът се експресира върху кръвни моноцити и тъканни макрофаги, освен това присъства в лимфоцити, фибробласти и ендотелни клетки[9,10]. CD68 има значение за фагоцитната активност на тъканните макрофаги както във вътреклетъчния лизозомен метаболизъм, така и в извънклетъчните клетъчни клетки и взаимодействие клетка-патоген[11].

Той се свързва с лектини и селектини, което позволява на макрофага да се фиксира в специфична тъканна област. CD68 циркулира между ендозоми и лизозоми, което позволява на макрофага да се движи по повърхността на субстрата, съдържащ селектин, или по повърхността на други клетки[11].

Активираните Т-клетки и някои зрели В-клетки също могат да експресират CD68, който обикновено се появява като точкова цитоплазмена или фино-зърнеста положителност чрез имунохистохимични техники[10].

Alivernini et al. (2019) изследват синовиална тъкан на пациенти, за да диференцират серонегативен периферен възпалителен артрит[8]. Авторите установяват, че CD68+ клетките са най-честите клетки на синовията на изследваните пациенти със серонегативен артрит (p<0.001) и тяхното изследване помага при диагностицирането на недиференцирани артрит от дегенеративно ставно засягане[8].

Fiechter et al. (2021) изследват влиянието на биологичната терапия върху синовиалната активност на пациенти с ПсA[9]. Авторите са използвали като маркер за активност на ПсA CD68+ синовиални макрофаги, оценявайки тяхното числово намаление, достигащо статистическа значимост и установяват числени намаления на всички инфилтриращи клетъчни подтипове на 12-та седмица, достигайки статистическа значимост за CD68+, поради което авторите предлагат изследването на CD68+ да се счита за белег на активност на заболяването[12].

Според van Kuijk и съавтори (2006) CD68+ положителни клетки се на­трупват в синовиума на ставите на болни от ревматоиден артрит и псориатичен артрит, където проявяват деструктивен и ремоделиращ потенциал и допринасят значително за ставно възпаление и разрушаване на ставите[13]. Според Baeten и съавтори (2005) плътността на макрофагите корелира с активността на ПсА[14], което се свързва с разрушителен ставен потенциал.

CD68 макрофаги и моноцити произвеждат провъзпалителни цитокини като интерлевкин-1β (IL-1β), IL-6, IL-12, IL-23 и TNF-α[15]. Алтернативно активирани макрофаги, които са противовъзпалителни и имунорегулаторни и поляризирани от Th2 цитокини като IL-4 и IL-13 и произвеждат противовъзпалителни цитокини като IL-10 и TGF-β[15]. При активен възпалителен или автоимунен процес, макрофагите освобождават TNF-α, IL-1β, IL-12 и IL-23, а по-късно IL-10 и TGF-β за потискане на възпалението и възстановяване на тъканите[15,16].

CD88 (C5a1 receptor, C5a anaphyl­a­toxin chemotactic receptor 1, C5a anaphylatoxin receptor, C5R1, Com­ple­ment component 5a receptor 1) е едноверижен протеин със седем обхващащи мембраната региони. CD88 се експресира от моноцити, неутрофили, еозинофили и други клетки[17]. CD88 е свързан с хетеротримерни G протеини и след свързването си с фракция на комплемента C5a, сигналът, трансдуциран от CD88, води до хемотаксис, освобождаване на ензими и супероксидни аниони, които увреждат всички елементи на ставите[17]. CD88 е представител на семейството на хемоатрактантните рецептори и се експресира в различни клетки и тъкани, като синовиоцити, астроцити, неутрофили/макрофаги, мастоцити, незрели дендритни клетки, ендотелни клетки, кераноцити[18]. Yuan и Wei (2003) изследват експресията на CD88 в синовиоцити от пациенти с автоимунен възпалителен артрит и остеоартрит и анализират освобождаването на тумор некрозис фактор алфа (TNF алфа) от синовиоцитите чрез ELISA[18]. Авторите установяват, че при 87.17% от изследваните пациенти се наблюдава експресия на CD88 и че тази синовиална експресия е свързана със значително подуване на ставите, скорост на утаяване на еритроцитите (ESR) и C-реактивен протеин (CRP). Активирането на комплекса CD88 с неговия лиганд C5a засилва освобождаване на TNF-алфа от синовиоцитите[18].

Mehta и съавтори (2015) проучват ефекта на блокирането CD88 със siRNAs фрагменти и установяват, че по този начин може да се реализира клиничен ефект и намаляване на артрита до 66% в животински модели, което е индиректно доказателство за активиране на CD68 при болни с артрит[19].

Експресията на CD68 и CD88 не са проучени достатъчно при болни с псориатичен артрит.

Целта на разработката е да оцени експресията на CD68 и CD88 в синовиалната тъкан на болни от псори­атичен артрит и гонартроза.

Материали и методи: 35 пациенти с диагноза на ПсА бяха включени в настоящото пилотно проучване; от тях всички са с полиартриткуларно периферно и централно засягане (CASPAR – критерии >3, DARSA >14), средната им възраст е 45.12±15.07 години, с давност на заболяването 5.67±3.24 год. Резултатите на болните с ПсА бяха сравнени с резултати на болни, страдащи от гонартроза (n=40, ACR критерии за гонартроза, 1991, III-IV степен по скалата на Kellgren-Lawrence). Биологичен материал от синовия на колянни стави, получен по време на операция за смяна на колянна става беше изследван имунохистохимично за експресия на CD68+ и CD88+ в Имунологичната лаборатория на Института по репродуктивна биология при БАН, София и в Катедрата по обща и патологична анатомия, Медицински факултет, МУ-Пловдив. От всяка една тъканна проба на болни с псориатичен артрит и гонартроза са направени поне 10 предметни стъкла и са изследвани от хистолог. За интензитета на оцветяването е приета скала 0 – липсва; 1 – слаб; 2 – умерено; 3 – силен интензитет, процентът на положително оцветените клетки се определя, както следва: при 0-10% = 0; 10-39% = 1; 40-69% = 2; 70-100% = 3. Имунохистохимичните резултати се разделят на три групи според наличието на положителни клетки: отрицателен резултат (-), слабо положителен резултат (+), силно положителен резултат (+++) на налични клетки според класификация, предложена от наблюдаващия хистолог.

Резултати: Сравнителният анализ на степента на тъканната експресия на CD68+ и CD88+ върху синовиалната тъкан на болни с ПсА и гонар­троза, измерени ординална скала (0 = липсва експресия, 1 = слаба експресия; 2 = умерено ниво на експресия и 3 = високо ниво на експресия) показва значително ниво на експресия на всички показатели (Табл. 1).

В групата на пациентите с ПсА се наблюдава по-високи ниво на CD68+, (рес­пек­тивно UCD68+=410.200, p<0.001). При пациентите с ПсА медианата е 2, а диапазонът 0-3, докато при пациентите с гонартроза медианата се колебае 0-1 при диапазон 0-3, като при всички наблюдавани активирани клетки разликата е достоверна (р<0.001).

Нивото на CD88+, което предста­влява С5а-рецептор, е достоверно по-ниско при болните с ПсА (UCD88+=305.300, p<0.001), като медианата е 0, а диапазонът 0-3, докато при пациентите с гонартроза медианата е 1 при диапазон 0-3.

CD68+ пептидът има значение за фагоцитарната активност на тъканните макрофаги, участва във вътреклетъчния лизозомен метаболизъм, както и във взаимодействията между отделените клетки[14]. Ние установихме, подобно на Alivernini и сътрудници, че нивото на CD68+ е увеличено в синовиалната тъкан на болни с ПсА в сравнение със синовиалната тъкан на болни с активирана гонартроза. Като израз на активиране на макрофаги, моноцити, фибробласти и дендритни клетки, маркерът CD68+ показва тъканна експресия, по-силно изразена при болни с висока клинична активност – DAPSA над 14.

В литературата няма данни за наличието CD88+ в синовиалната мембрана на болни с ПсА. Според нашите данни CD88+ маркерът (установен върху макрофаги, фибробласти, неутрофили) се намират в понижено количество в синовията на болни с ПсА в сравнение с болни с гонартроза.

Според Furebring и сътрудници нивото на CD88+ е силно намалено при тежки инфекции като сепсис или септичен шок, въпреки че общото ниво на комплементарните фракции е увеличено в серума на болните. Нашите резултати показват ниско ниво на CD88+ клетки (макрофаги, фибробласти, неутрофили), което вероятно е свързано с повишеното ниво на С5а фракцията на комплемента, а като последствие на това свързването му със CD88+, поради което той се установява в ниско количество.

Неутрофилните левкоцити имат важна роля както за инициирането, така и за прогресирането на ПсA, а голям брой активирани неутрофили се откриват както в синовиалната течност, така и в синовиалната тъкан на болни с ПсА. Увеличеното ниво на неутрофили и дендритни клетки са свързващото звено между вродения и придобития имунитет, които изглежда са въвлечени в патогенезата на ПсА. Нашите резултати разширяват разбирането за молекулярните промени, които се случват с неутрофилите във възпалени стави при ПсA. Вероятно неутрофилите губят своите миграционни свойства и генерират сигнали, които насърчават увреждане на ставите чрез и активиране както на вродения, така и на адаптивния имунен отговор. Предполагаме, че тези активирани неутрофили допринасят за хроничното възпаление и прогресивното увреждане на хрущяла и субхондралната кост, наблюдавани при пациенти с ПсA.